Вы здесь

Главная » Общие вопросы пульмонологии » Методы исследования пульмонологических больных

В современных микробиологических лабораториях используются серологические методы и методы экспресс-диагностики.
В целях выявления микробных возбудителей используются классические серологические методы исследования, базирующиеся на выявлении специфических антител и антигенов с помощью реакции антиген-антитело. В исследовании применяются парные сыворотки, полученные от больных в начале болезни и через 2—3 нед. Для выявления антител, накопившихся в сыворотке крови, используется реакция связывания комплемента, реакция торможения гемагглютинации, реакция нейтрализации. Диагностическое значение имеет существенный рост в динамике концентрации антител в крови.
В клинической микробиологии серологические методы применяют для диагностики инфекций, вызванных легионеллами, риккетсиями, хламидиями, микоплазмами. Чаще всего используют реакцию связывания комплемента в динамике: в начале заболевания и через 2 нед. Выявление специфических антител и роста в динамике их титра в 4 и более раз свидетельствует об инфекционном процессе.
В настоящее время во многих микробиологических лабораториях стали широко использовать иммунологические методы экспресс-диагностики, которые дают возможность изучать биологический материал без выделения культуры возбудителя. Результат получается быстро, в течение нескольких часов. К ним относятся иммунофлюоресцентный метод (РИФ), а также методы радиоиммунного (РИА) и иммуноферментного (ИФА) анализов.

 

Иммунофлюоресцентный метод, или реакция иммунофлюоресценции (РИФ), используется в микробиологических лабораториях, оборудованных люминесцентным микроскопом. В исследовании применяются прямая и непрямая реакции иммунофлюоресценции.
При использовании для диагностики прямой реакции иммунофлюоресценции на предметное стекло наносят зафиксированный этанолом клинический материал. Затем в него добавляют люминесцентную сыворотку. Проводят осмотр препарата под люминесцентным микроскопом. Иммунологическая реакция антиген-антитело происходит непосредственно на предметном стекле. Например, гриппозный антиген, который соединился с меченым иммуноглобулином, под микроскопом имеет вид ярких светящихся частиц, размещенных в ядре и цитоплазме зараженных клеток. Метод простой, но для его выполнения необходимы люминесцентные сыворотки к каждому типу антигенов.
Суть непрямой реакции иммунофлюоресценции заключается в том, что сначала на предметном стекле антиген связывается со специфической (немеченой) сывороткой. К образованному на стекле комплексу антиген-антитело добавляют люминесцентную сыворотку. Конечным этапом является микроскопия, которая выявляет меченые комплексы. При этом методе расходуется небольшое количество люминесцентных сывороток, поэтому он широко используется для выявления бактериальных, риккетсиозных, пневмоцистных инфекций. Он позволяет легко идентифицировать вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, цитомегаловирус. Диагностику легионеллезной и хламидийной инфекции следует также производить с помощью реакции иммунофлюоресценции на определение соответствующего антигена.
Радиоиммунный анализ (РИА) — меченный радионуклидом антиген одновременно с немеченым добавляют к антителам. Антигены конкурируют между собой за связывание антител до достижения равновесия. Метод очень точен, но его применение в практической медицине ограничивается необходимостью изготовления дорогостоящих химически чистых антигенов, меченных радионуклидом.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — осуществляется так же, как радиоиммунный анализ, но вместо радионуклидной метки используются ферменты, которые связываются с антителами. При этом образуется конъюгант фермента, количество которого определяется проведением цветной реакции с добавлением определенного химического вещества. Спектрофотометрическим методом определяют количество антител в жидкостях и тканях больного. Метод является перспективным для широкого клинического применения. Им можно определить антитела к самым распространенным возбудителям инфекций: пневмококкам, гемофильной и синегнойной палочкам, легионелле, вирусам и грибам. Так, диагностику микоплазменной инфекции следует проводить ИФА, выявляющего специфические IgG и IgM, а диагностику хламидийной инфекции с помощью ИФА, выявляющего специфический IgG.

 

Автоматизация при идентификации микроорганизмов 
При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой микроорганизма, выделенной общепринятыми (классическими) методами. При этом решающим фактором успеха правильного выделения культуры является качество питательных сред, используемых для первичного посева биоматериалов, а также соблюдение соответствующих условий культивирования.
Результат идентификации микроорганизмов в традиционных исследованиях получают не ранее чем через 4—7 сут с момента первичного посева биологического материала. На современном уровне быстрый и точный результат может быть получен при использовании готовых микрообъемных слайд-тестов и тест-систем для идентификации микроорганизмов.
Слайд-тесты для биохимической идентификации представляют собой готовые к использованию полистероловые планшеты или панели с сухими дифференциальными средами или субстратами. В одних диагностических системах субстраты находятся в ячейках, в других — в шаблонах-носителях. Так, тест-наборы Микро-Ла-Тест содержат одновременно 7—24 субстрата для идентификации энтеробактерий и вибрионов, стафилококков, стрептококков, энтерококков, неферментирующих грамотрицательных бактерий, анаэробов, нейссерий. Кроме тест-систем, дополнительно рекомендуется использовать диагностические полоски и диски, которые позволяют производить селективную изоляцию и дифференциацию бактерий, а также определение их чувствительности к антибиотикам путем выявления роста или его угнетения прямо на питательной среде.
После добавления суспензий исследуемых микроорганизмов субстраты растворяются. При инкубации в ячейках происходят биохимические реакции, результаты которых регистрируются визуально по изменению цвета индикатора или после добавления реактива, либо автоматически с помощью фотометрии.
Использование готовых слайд-тестов и тест-систем существенно упрощает и стандартизирует ежедневную рутинную работу микробиологических лабораторий. Наиболее эффективными для идентификации различных микроорганизмов являются зарубежные диагностические системы API, BBL Crystal, MicroScan, MicroTax, позволяющие в течение 3—48 ч не только идентифицировать микроорганизмы, но и определить их чувствительность к антибиотикам.
В настоящее время созданы специальные компьютерные программы (например, программа МИКРОБ-автомат в России), позволяющие производить автоматическое считывание результатов с тест-систем и обрабатывать полученные данные. Преимуществами таких программ являются возможность расширения числа идентифицируемых видов микроорганизмов, спектра изучаемых признаков (тестов), повышение точности получения конечного результата и сокращение сроков исследования до 1—2 сут от момента выделения чистой культуры.

Спонсоры сайта:

uptolike

Сбор новостей