Микробиологические методы исследования пульмонологического больного

Основным условием эффективности микробиологических исследований является проведение их в начале заболевания или его обострения, до лечения антибактериальными препаратами. Применение антибиотиков и сульфаниламидов в 3—4 раза снижает частоту выделения патогенных микроорганизмов (D. pneumoniae и Н. influenzae). В процессе антибактериальной терапии возможно развитие резистентных к антибиотикам форм микробов и возникновение дисбактериоза, что очень затрудняет определение этиологии заболевания.
Предварительная обработка и посев должны проводиться не позднее чем через 1—2 ч после сбора материала, так как более длительное пребывание его в условиях комнатной температуры приводит к гибели имеющих наибольшее этиологическое значение пневмококков, Н. influenzae и других чувствительных микроорганизмов и размножению микробов, устойчивых к воздействию внешней среды: стафилококков, грамотрицательных энтеробактерий и других.
Важным условием эффективности микробиологических исследований является динамическое изучение микрофлоры (не менее 2—3 раз в течение болезни), что дает возможность уточнить этиологию патологического процесса, проследить длительность персистенции возбудителя, контролировать эффективность проводимой терапии, а также выявлять иногда наблюдающуюся смену этиологических факторов.

Микробиологические исследования выполняются по следующей схеме:
1.         Обработка материала («отмывка», гомогенизация, приготовление серийных разведений, центрифугирование и т. д.). Наиболее эффективно исследование материала проводить с помощью количественного метода, используя для гомогенизации мокроты и смывов из бронхов муколитический препарат N-ацетил-1-цистеин или различные механические способы. Посев серии десятикратных разведений исходного материала дает возможность выделить большее число видов микроорганизмов, так как удается преодолеть антагонистические взаимоотношения между различными членами ассоциации, получить достоверное суждение об их количестве и соотношении, проследить их изменение в течение болезни и лечения, т. е. объективно оценить эффективность проводимой терапии.
2.         Посев на ряд питательных сред, преимущественно элективных и селективных, и заражение испытуемым материалом лабораторных животных.
3.         Микроскопия нативных и окрашенных мазков исходного материала.
4.         Выделение чистых культур.
5.         Определение рода и вида микробов на основании изучения морфологических, тинкториальных, биохимических и антигенных свойств чистых культур. При необходимости проводится изучение патогенности выделенных штаммов для лабораторных животных.
6.         Изучение чувствительности выявленного возбудителя или вероятных патогенных агентов к 10—12 антибиотикам методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков. Возможное изменение антибиотикограммы одного и того же вида микроорганизма в течение болезни, обусловленное селекционным и мутагенным действием применяемых антибактериальных препаратов, требует многократного определения этих свойств бактерий, особенно при отсутствии эффективности проводимой терапии, для внесения соответствующих коррективов в лечение больного.
Ввиду ведущей роли пневмококков и Н. influenzae в возникновении острых и обострении хронических воспалительных заболеваний легких необходимо остановиться на некоторых особенностях биологических свойств этих микроорганизмов, на способах их выделения и идентификации.
По данным различных авторов, частота выделения пневмококков при инфекционных процессах в легких колеблется в очень широких пределах — от 8 до 96%, что связано с использованием различных питательных сред и биопроб на животных. Наиболее эффективно выделение пневмококков при заражении исходным материалом белых мышей. Но это очень трудоемкий и дорогостоящий метод, что значительно ограничивает возможность его массового применения. Поэтому проводились и проводятся поиски чувствительных питательных сред, способных заменить биопробы на животных при выделении диплококков пневмонии. В настоящее время самой эффективной питательной средой является свежеприготовленный агар на переваре Хоттингера с 5% эритроцитов лошади или барана (О. К. Лунева, 1971) или селективная среда с гентамицином (Hendley и соавт., 1975). Применение этих сред практически исключает необходимость выделения пневмококков на белых мышах. Дифференцирование D. pneumoniae от культурально подобных стрептококков осуществляется в основном по лизису культур в бульоне, содержащем 10% желчи крупного рогатого скота. Серотипирование проводится с помощью реакции агглютинации или Нейфельда.
На протяжении последнего десятилетия произошло изменение отношения циркулирующих штаммов пневмококков к антибиотикам: в настоящее время как за рубежом, так и в нашей стране большинство выделяемых культур резистентно к широко применяемым препаратам Тетрациклинового ряда, но произошла реверсия чувствительности данных диплококков к пенициллину. Так, в Ленинграде большинство штаммов пневмококков устойчиво к тетрациклину и моиомицину, но высокочувствительно к пенициллину и эритромицину. Выраженное антибактериальное действие в отношении пневмококков большинства широко применяемых при лечении НЗЛ антибиотиков и сульфаниламидов затрудняет или полностью исключает возможность выделения D. pneumoniae. Кажущееся отсутствие пневмококков препятствует проведению этиотропной терапии и контролю за ее эффективностью.
Частота выделения Н. influenzae при острых и обострении хронических инфекционных процессов в легких колеблется в очень широких пределах — от 5 до 100%, что связано с высокой чувствительностью к воздействию внешней среды и антибактериальной терапии, а также объясняется большой требовательностью их к составу питательной среды и антагонистическим влиянием на рост данных грамотрицательных палочек других микроорганизмов, в том числе пневмококков. Существует корреляция между характером мокроты и возможностью выделения Н. influenzae: наиболее часто и в большем количестве эти бактерии обнаруживаются в гнойном бронхиальном секрете. Использование различных сред (шоколадного агара, среды Левинталя, агара с эритроцитами кролика, стафилококковой кормушкой или штрихом Staph. aureus) показало, что выделение Н. influenzae практически невозможно без добавления в данные питательные субстраты антибиотика бацитрацина, угнетающего рост многих микробов бронхиального секрета и верхних дыхательных путей — антагонистов Н. influenzae, но не влияющего на размножение гемоглобинофильных палочек.
Идентификация выделенных культур осуществляется на основании определения их биологической активности, а главным образом антигенных свойств. Но определение последних очень затруднено тем, что только 4—8% штаммов, изолированных из дыхательного тракта, имеют капсулу и могут быть серотипиро- ваны. Долго существовавшее представление о высокой чувствительности Н. influenzae к ампициллину в последнее время поколеблено появившимися сообщениями о нарастании устойчивости и числа резистентных культур этих палочек к данному антибиотику
Определение этиологии воспалительных заболеваний легких должно основываться на эпидемиологических и клинических данных, а также на результатах бактериологических, вирусологических и иммунологических исследований. Таким образом, вопрос о природе заболевания должен решаться совместно клиницистом, микробиологом и иммунологом.
При микробиологическом исследовании пульмонологических больных из мокроты и смывов бронхов нередко выделяется ассоциация микробов, а условная патогенность некоторых из них создает большие трудности в определении этиологии заболевания или его обострения. Наиболее трудным является вопрос об этиологической значимости отдельных микроорганизмов, так как отсутствуют общепринятые способы и критерии ее оценки.
В настоящее время наиболее достоверными при выявлении этиологии заболевания надо считать следующие результаты микробиологического исследования пульмонологических больных:
1.         Выделение монокультуры микроба из пунктата легких, или абсцесса, или плеврального экссудата.
2.         Выделение монокультуры патогенных или условно патогенных микроорганизмов из крови в сочетании с преобладанием этого же вида микробов в бронхиальном секрете по данным исследования мокроты или смывов из бронхов.
3.         Обнаружение в двух-трех последующих исследованиях большого количества (106/мл и выше для мокроты и 104/мл и выше для смывов из бронхов) одного и того же патогенного или условно
патогенного микроорганизма.
Ввиду относительно позднего образования антител, особенно достижения диагностического (не менее чем четырехкратного) нарастания их титра, и в целях более раннего применения этиотропной терапии определение этиологии заболевания может быть основано на совокупности эпидемиологических данных, особенностей клинического течения и наличия одного из трех перечисленных выше микробиологических критериев.
В заключение необходимо подчеркнуть, что выявление возбудителя неспецифических воспалительных заболеваний легких возможно только при соблюдении определенных условий главным из которых являются проведение микробиологических исследований до начала антибактериальной терапии, динамичность наблюдений и применение методов обработки патологического материала, среди которых наиболее эффективным признан количественный анализ микрофлоры. Основным микробиологическим критерием этиологической значимости, определение которого доступно широкому кругу лабораторий, является количественное преобладание того или иного патогенного или условно патогенного микроорганизма в течение 2—3 последующих исследований.